Los ARN libres de células (cfRNAs) son analitos prometedores como biomarcadores no invasivos y tienen un potencial aún mayor si se combinan con la metabolómica. Plasma es una fuente óptima para cfRNAs pero a menudo se deriva de una variedad de anticoagulantes. El plasma obtenido en heparina es adecuado para la metabolómica pero es difícil de utilizar para el análisis subsecuente basado en qPCR. En el presente estudio, nuestro objetivo fue desarrollar un protocolo de heparinasa simple, eficiente en tiempo y rentable, seguido por la preparación de la biblioteca y la secuenciación de cfRNAs de plasma humano extraído y almacenado en heparina a -80 grados Celsius durante varios años. La sangre se recolectó en tubos de heparina sódica CPT(tm) de pacientes con infección crónica por VHC (NCT02400216) en el Centro Clínico de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Los cfRNAs de plasma fueron tratados con heparinasa I y utilizados para la preparación de la biblioteca y la secuenciación de próxima generación (NGS). El tratamiento con heparinasa mantuvo la integridad del ARN y permitió la preparación exitosa de la biblioteca para todos los sujetos del estudio incluso con 7 ng de cfRNAs como material inicial. El informe de clasificación derivado del paquete Pavian R v1.2.0 no mostró lecturas artificiales. La abundancia de lecturas de cordados sobre las lecturas microbianas sugiere que no se agregó ningún error experimental a través del tratamiento con heparinasa I. Presentamos un enfoque novedoso y práctico para el tratamiento con heparinasa de plasma humano recolectado y congelado en heparina sódica durante varios años. Esta es una demostración efectiva de la utilización de plasma de heparina para NGS e investigación transcriptómica subsecuente, que luego podría integrarse con la metabolómica de las mismas muestras, maximizando la eficiencia y minimizando las extracciones de sangre.