Todos los organismos terrestres están sujetos a presiones evolutivas asociadas con fuentes naturales de radiación ionizante (RI). El legado de la RI inducida por humanos asociada con la energía, la producción de armas, la medicina y la investigación ha cambiado la distribución y la magnitud de estas presiones evolutivas. Hasta la fecha, ningún estudio ha examinado sistemáticamente los efectos de dosis de exposición a la radiación ambientalmente relevantes en todo el proteoma de un organismo. Esta falta de conocimiento se ha debido, en parte, a deficiencias tecnológicas que han dificultado la cuantificación de dosis de RI ambientalmente relevantes y la detección sensible de respuestas proteómicas. Aquí describimos un protocolo que aborda ambas necesidades, combinando la entrega cuantificable de RI con un método confiable para obtener comparaciones proteómicas de peces Medaka control y irradiados. Las exposiciones se realizaron en el Laboratorio de Ecología del Río Savannah (SREL, en Aiken, SC), donde los peces fueron posteriormente disecados en tres conjuntos de tejidos (cuerpos, órganos e intestinos) y congelados hasta el análisis. Las proteínas de los tejidos fueron extraídas, resueltas por Electroforesis en Gel de Poliacrilamida con Dodecil Sulfato de Sodio (SDS-PAGE), y cada carril de muestra fue dividido en diez porciones iguales. Tras la digestión tríptica en gel, los péptidos liberados de cada porción de gel fueron identificados y cuantificados por Espectrometría de Masas con Cromatografía Líquida (LC-MS/MS) para obtener el estudio comparativo más completo hasta la fecha de las respuestas proteómicas a dosis de RI ambientalmente relevantes. Este método proporciona un enfoque simple para su uso en estudios epidemiológicos en curso de la exposición crónica a niveles de RI ambientalmente relevantes y también debería funcionar bien en estudios fisiológicos, de desarrollo y toxicológicos.