El procesamiento de proteínas fluorescentes puede prevenir la detección de partículas priónicas en [] células
Autores: Matveenko, Andrew G.; Ryzhkova, Varvara E.; Zaytseva, Natalia A.; Danilov, Lavrentii G.; Mikhailichenko, Anastasia S.; Barbitoff, Yury A.; Zhouravleva, Galina A.
Idioma: Inglés
Editor: MDPI
Año: 2022
Acceso abierto
Artículo científico
2022
El procesamiento de proteínas fluorescentes puede prevenir la detección de partículas priónicas en [] células
Categoría
Ciencias Naturales y Subdisciplinas
Subcategoría
Biología
Palabras clave
Levadura
Agregación de proteínas
Sup35
Priones
Proteínas fluorescentes
Proteólisis
Licencia
CC BY-SA – Atribución – Compartir Igual
Consultas: 12
Citaciones: Sin citaciones
La levadura es un modelo conveniente para estudiar la agregación de proteínas, ya que se sabe que propaga priones amiloides. [] es la forma priónica del factor de liberación eRF3 (Sup35). El Sup35 agregado causa defectos en la terminación de la traducción, lo que resulta en la supresión de nonsense en cepas que llevan codones de parada prematuros. Los dominios N-terminal y medio (M) de Sup35 son necesarios y suficientes para mantener [] en las células mientras se preservan las propiedades de la cepa priónica. Por esta razón, el Sup35NM fusionado a proteínas fluorescentes se utiliza a menudo para la detección e investigación de []. Sin embargo, encontramos que en tales construcciones quiméricas, no todas las proteínas fluorescentes permiten la detección confiable de agregados de Sup35. En particular, la sobreproducción transitoria de Sup35NM-mCherry resultó en un patrón fluorescente difuso en las [] células, mientras que no se pudo observar pérdida de priones ni efecto en las propiedades priónicas de Sup35NM. Este efecto se reprodujo en varios antecedentes de cepas no relacionadas y variantes de priones. En contraste, el Sup35NM fusionado a otra proteína fluorescente roja, TagRFP-T, permitió la detección de agregados de []. El análisis de lisados de proteínas mostró que el Sup35NM-mCherry se degrada activamente en la célula. Esta degradación no fue causada por proteasas vacuolares ni por el sistema ubiquitina-proteasoma implicado en el procesamiento de Sup35. A pesar de que la intensidad de esta proteólisis fue mayor que la de Sup35NM-GFP, fue aproximadamente la misma que en el caso de Sup35NM-TagRFP-T. Así, es posible que, a diferencia de TagRFP-T, los productos de degradación de Sup35NM-mCherry aún conserven sus propiedades fluorescentes mientras pierden la capacidad de decorar agregados de Sup35 preexistentes. Esto resulta en fluorescencia difusa a pesar de la presencia de los agregados priónicos en la célula. Por lo tanto, el etiquetado con proteínas fluorescentes debe usarse con precaución, ya que tal proteólisis puede aumentar la tasa de resultados falsos negativos al detectar células portadoras de priones.
Descripción
La levadura es un modelo conveniente para estudiar la agregación de proteínas, ya que se sabe que propaga priones amiloides. [] es la forma priónica del factor de liberación eRF3 (Sup35). El Sup35 agregado causa defectos en la terminación de la traducción, lo que resulta en la supresión de nonsense en cepas que llevan codones de parada prematuros. Los dominios N-terminal y medio (M) de Sup35 son necesarios y suficientes para mantener [] en las células mientras se preservan las propiedades de la cepa priónica. Por esta razón, el Sup35NM fusionado a proteínas fluorescentes se utiliza a menudo para la detección e investigación de []. Sin embargo, encontramos que en tales construcciones quiméricas, no todas las proteínas fluorescentes permiten la detección confiable de agregados de Sup35. En particular, la sobreproducción transitoria de Sup35NM-mCherry resultó en un patrón fluorescente difuso en las [] células, mientras que no se pudo observar pérdida de priones ni efecto en las propiedades priónicas de Sup35NM. Este efecto se reprodujo en varios antecedentes de cepas no relacionadas y variantes de priones. En contraste, el Sup35NM fusionado a otra proteína fluorescente roja, TagRFP-T, permitió la detección de agregados de []. El análisis de lisados de proteínas mostró que el Sup35NM-mCherry se degrada activamente en la célula. Esta degradación no fue causada por proteasas vacuolares ni por el sistema ubiquitina-proteasoma implicado en el procesamiento de Sup35. A pesar de que la intensidad de esta proteólisis fue mayor que la de Sup35NM-GFP, fue aproximadamente la misma que en el caso de Sup35NM-TagRFP-T. Así, es posible que, a diferencia de TagRFP-T, los productos de degradación de Sup35NM-mCherry aún conserven sus propiedades fluorescentes mientras pierden la capacidad de decorar agregados de Sup35 preexistentes. Esto resulta en fluorescencia difusa a pesar de la presencia de los agregados priónicos en la célula. Por lo tanto, el etiquetado con proteínas fluorescentes debe usarse con precaución, ya que tal proteólisis puede aumentar la tasa de resultados falsos negativos al detectar células portadoras de priones.