es un parásito intracelular ubicuo que infecta casi todos los animales de sangre caliente, incluidos los humanos. Se basa en efectores secretados para manipular su entorno y garantizar su supervivencia. Clave para su capacidad de establecer y mantener la infección son varios efectores secretorios, particularmente las proteínas de gránulos densos (GRAs). Aunque se han identificado más de 100 GRAs, muchos siguen siendo poco caracterizados. En este estudio, examinamos la localización subcelular y los roles biológicos de cuatro GRAs predichos (GRA85-88). El análisis de inmunofluorescencia de cepas etiquetadas endógenamente reveló que estas proteínas se localizan en el vacuolo parasitóforo en taquizoítos y en la matriz del quiste en bradizoítos. Usando la tecnología CRISPR-Cas9, generamos cepas knockout para cada gen, y los ensayos fenotípicos demostraron que GRA86 es importante para la virulencia del parásito y la formación de quistes en el cerebro durante la infección crónica con la cepa tipo II Pru, aunque no es necesaria para el crecimiento in vitro. En contraste, GRA85, GRA87 y GRA88 fueron individualmente prescindibles tanto para la aptitud in vitro como in vivo. Un perfil transcripcional adicional y ensayos in vitro sugirieron que GRA86 desempeña un papel fundamental en la diferenciación de bradizoítos. En conjunto, estos hallazgos destacan el papel significativo de GRA86 en la infección crónica y la conversión de etapas, posicionándolo como un objetivo prometedor para futuras intervenciones terapéuticas.