El estrés por sequía afecta negativamente el metabolismo y el crecimiento de las plantas, desencadenando mecanismos de defensa complejos para limitar el daño. Este estudio evaluó la efectividad de una única aplicación foliar de 1 mM de L-prolina (Pro) en trigo de invierno (L., cv. Bohemie) en dos experimentos separados que difieren en el intervalo de tiempo entre la aplicación y la sequía: 7 días (experimento 1) y 35 días (experimento 2). Se midieron la tasa neta de fotosíntesis (A), la tasa de transpiración (E), la conductancia estomática (g), el potencial hídrico de la hoja (w), la eficiencia intrínseca en el uso del agua (WUE), el contenido endógeno de prolina (Pro), el contenido de malondialdehído (MDA) y el rendimiento cuántico máximo del fotosistema II (F/F). En el experimento 1, la sequía redujo notablemente la tasa neta de fotosíntesis, la tasa de transpiración, la conductancia estomática y el potencial hídrico de la hoja en ambos tratamientos estresados por la sequía, es decir, sin plantas con imprimación (S) y con plantas con imprimación de Pro (SPro). El contenido de Pro y MDA aumentó bajo estrés. Una mayor E y g en el tratamiento SPro indicaron una regulación estomática más efectiva y una estrategia de uso de agua distinta. El contenido de Pro fue significativamente menor en SPro en comparación con S, mientras que las diferencias en los niveles de MDA entre estos tratamientos no fueron estadísticamente significativas. El segundo período de sequía (D2) llevó a limitaciones más pronunciadas en el intercambio de gases en S y SPro. La osmorregulación mejorada se reflejó en un menor w (S < SPro) y una mayor acumulación de Pro en S (S > SPro). El efecto de la Pro exógena persistió en forma de una síntesis de Pro endógena reducida y una protección mejorada del fotosistema II. La rehidratación de las plantas estresadas restauró todos los parámetros fisiológicos monitoreados, y las plantas tratadas con Pro mostraron una recuperación más eficiente del intercambio de gases. El experimento 2 demostró un efecto de imprimación duradero que mejoró la preparación de las plantas para futuros eventos de sequía. En el tratamiento SPro, esta memoria del estrés respaldó una osmorregulación más eficiente, una menor peroxidación de lípidos, una protección mejorada de la integridad del fotosistema II y un reinicio más efectivo del intercambio de gases tras la rehidratación. Nuestros hallazgos resaltan el potencial de la prolina exógena como una herramienta práctica para mejorar la resistencia de los cultivos al estrés por sequía inducido por el clima.