La prolactina (PRL) juega un papel importante en el desarrollo de los folículos animales y la ovulación. Sin embargo, sus efectos regulatorios en las diferentes etapas del ciclo estral en ovejas no están claros. En este estudio, se utilizó bromocriptina (BCR, inhibidor de PRL) para estudiar el efecto de la PRL en la secreción de hormonas reproductivas y expresiones génicas con el fin de explorar sus efectos regulatorios en el ciclo sexual de las ovejas. Ochenta ovejas sanas con la misma paridad y pesos similares fueron asignadas aleatoriamente al grupo de control (C, n = 40) y al grupo de tratamiento (T, n = 40, alimentadas con bromocriptina). Después de la sincronización del estro, se seleccionaron treinta y una ovejas con signos evidentes de estro de cada grupo. Se obtuvieron seis muestras de sangre aleatoriamente mediante punción venosa yugular para medir la concentración de PRL, estrógeno (E), progesterona (P), hormona luteinizante (LH), hormona foliculoestimulante (FSH) y hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH) en proestro, estro, metestro y diestro. Al mismo tiempo, recolectamos los ovarios de las seis ovejas in vivo después de la anestesia para detectar el conteo de folículos y cuerpos lúteos (CL) y medir la expresión de genes relacionados con receptores hormonales y apoptosis. Los resultados muestran que la inhibición de PRL no tuvo efectos significativos en la duración del ciclo estral (> 0.05). En proestro, el número de folículos grandes y pequeños, los niveles de E, FSH y GnRH, y las expresiones de los genes apoptóticos aumentaron (< 0.05); y el número de folículos intermedios y la expresión del gen antiapoptótico disminuyeron (< 0.05) en el grupo T. En estro, el número de folículos grandes, los niveles de E y GnRH, y las expresiones de los genes aumentaron (< 0.05), y el número de folículos intermedios disminuyó (< 0.05) en el grupo T. En metestro, el número de folículos pequeños y la expresión del gen pro-apoptótico aumentaron (< 0.05); el número de folículos intermedios disminuyó (< 0.05) en el grupo T. En diestro, el número de folículos grandes, folículos intermedios y CL, el nivel de P, y las expresiones de los genes aumentaron (< 0.05); el número de folículos pequeños y la expresión del gen disminuyeron (< 0.05) en el grupo T. En resumen, la inhibición de PRL puede afectar la secreción de hormonas reproductivas, el conteo de folículos y la expresión génica durante el ciclo estral. Estos resultados proporcionan una base para comprender los mecanismos subyacentes a la regulación del ciclo estral de las ovejas por la PRL.