La prolactina es esencial para el desarrollo de la glándula mamaria y la lactancia. La progesterona también induce la ramificación ductal y la formación alveolar a través de la diferenciación secretora inicial dentro de la glándula mamaria. En este estudio, nuestro objetivo fue evaluar el papel de la progesterona como sustituto de la prolactina para la producción de componentes de leche cultivados en células MAC-T. Las células fueron tratadas con varias hormonas como prolactina (PRL), progesterona (P4), 17beta-estradiol (E2), cortisol (COR) e insulina (INS) durante 5 días. Las células MAC-T cultivadas en un medio de diferenciación con P4 (2500 ng/mL de P4, 25 ng/mL de E2, 25 ng/mL de COR y 25 ng/mL de INS) mostraron niveles similares de factor E74-like 5 (Elf5) y síntesis de componentes de leche (-caseína, -caseína, -lactalbumina, beta-lactoglobulina y triglicéridos) en comparación con aquellas cultivadas en un medio de diferenciación con PRL (5000 ng/mL de PRL, 500 ng/mL de CORT y 50 ng/mL de INS). Los niveles de -caseína y triglicéridos en el medio de diferenciación óptimo con P4 estaban presentes en niveles comparables a los del medio de diferenciación con PRL. Nuestros resultados demostraron que P4 induce la activación de Elf5 y la síntesis de componentes de leche en células MAC-T, similar a la PRL. Por lo tanto, P4 puede ser utilizado como un sustituto efectivo de la PRL para la producción de leche cultivada en células en marcos in vitro.