El babaco, un cultivo de frutos propagado vegetativamente nativo de Ecuador, es apreciado por su sabor distintivo y propiedades nutricionales. El objetivo de esta investigación fue determinar un protocolo funcional para la propagación por cultivo de tejidos de plantas de babaco libres de virus, incluyendo el establecimiento in vitro, la multiplicación, el enraizamiento y la aclimatación. Primero, se analizaron plantas de babaco asintomáticas de un solo vivero comercial para la detección de virus y se cuidaron utilizando diferentes tratamientos de desinfección en el invernadero para reducir la contaminación durante el paso de establecimiento in vitro, y se utilizaron tres citoquininas, 6-(,-Dimetilalilamino) purina (2IP), 6-Benzilaminopurina (BAP) y Tidiazuron (TDZ), para determinar la mejor hormona para la multiplicación. El mejor tratamiento para la desinfección de plantas fue la aplicación semanal de sulfato de cobre en el invernadero y una desinfección en laboratorio utilizando etanol (EtOH) (70%), Clorox (2%) y una solución de povidona yodada (2.5%), con un 80% de supervivencia durante el establecimiento de plantas in vitro. TDZ mostró una mejor tasa de multiplicación en comparación con otras hormonas, y el 70% de las plantas enraizadas se aclimataron con éxito en el invernadero. Las plantas generadas estaban libres de virus cuando se probaron contra el virus del mosaico del babaco (BabMV) y el virus de la mancha anular de la papaya (PRSV), dos de los virus más importantes que pueden afectar al babaco. Se elaboró un protocolo eficiente para producir plantas de babaco libres de virus con un uso integrado de herramientas de diagnóstico viral para garantizar la producción de material de inicio saludable para los agricultores.