Los ginsenósidos, los compuestos activos principales en especies, son glucósidos de protopanaxadiol (PPD) o protopanaxatriol (PPT). Los ginsenósidos de tipo PPT tienen actividades farmacológicas únicas en el sistema nervioso central y el sistema cardiovascular. Como un ginsenósido no natural, 3,12-Di--D-glucopiranósil-dammar-24-eno-3,6,12,20-tetraol (3,12-Di--Glc-PPT) puede ser sintetizado a través de reacciones enzimáticas pero está limitado por los sustratos costosos y la baja eficiencia catalítica. En el presente estudio, producimos con éxito 3,12-Di--Glc-PPT con un título de 7,0 mg/L al expresar la protopanaxatriol sintasa (PPTS) de y UGT109A1 de en levadura productora de PPD. Luego, modificamos esta cepa ingenierizada reemplazando UGT109A1 con su mutante UGT109A1-K73A, sobreexpresando la citocromo P450 reductasa ATR2 de y las enzimas clave de la biosíntesis de UDP-glucosa para aumentar la producción de 3,12-Di--Glc-PPT, aunque estas estrategias no mostraron ningún efecto positivo en el rendimiento de 3,12-Di--Glc-PPT. Sin embargo, el ginsenósido no natural 3,12-Di--Glc-PPT fue producido en este estudio al construir su vía biosintética en levadura. Hasta donde sabemos, este es el primer informe de producción de 3,12-Di--Glc-PPT a través de fábricas de células de levadura. Nuestro trabajo proporciona una ruta viable para la producción de 3,12-Di--Glc-PPT, lo cual sienta las bases para la investigación y desarrollo de medicamentos.