En la actualidad, el método catalizado por una doble enzima utilizando la sintasa de maltooligosil trehalosa (MTSasa) y la trehalohidrolasa de maltooligosil trehalosa (MTHasa) es la tecnología principal para la producción industrial de trehalosa. Sin embargo, MTSasa y MTHasa se preparan principalmente mediante la expresión heteróloga en cepas modificadas hasta ahora. En este estudio, primero demostramos que la adición de 3 U/g de pululanasa neutral PulA podría aumentar la tasa de conversión de trehalosa en 2.46 veces en el sistema catalizado por doble enzima. Luego, se utilizó un dominio CBM68 para ayudar con éxito a la expresión secretora de MTSasa y MTHasa de S34 en SCK6. Sobre esa base, se construyó una cepa modificada PSH02 (::/pHT43-C68-ARS/pMC68-ARH), que coexpresaba MTSasa, MTHasa y PulA. Después de la fermentación de 24 h de PSH02, se obtuvo la proporción óptima de las multi-enzimas extracelulares para lograr la mayor tasa de conversión de trehalosa del 80% a partir de 100 g/L de maltodextrina. La alta estabilidad de pasaje y la estabilidad de conservación de multi-enzimas convirtieron a PSH02 en una excelente cepa de producción industrial. Además, la producción de trehalosa utilizando estas enzimas extracelulares producidas mediante la fermentación de una sola etapa de PSH02 simplificaría enormemente el procedimiento de preparación de multi-enzimas y se espera que reduzca los costos de producción.