La energía de biomasa transforma residuos en biocombustibles y apoya la purificación del agua. Este estudio examina la producción mejorada de hidrógeno a través de la fermentación oscura, rastreando ácidos grasos volátiles (AGVs), demanda química de oxígeno (DQO), carbohidratos y tiempo de retención hidráulica (TRH) para optimizar el rendimiento y la calidad del biogás. Las investigaciones sobre acidogénesis y acetogénesis exploran métodos para descomponer AGVs de cadena larga en AGVs de cadena corta, que son críticos para la generación eficiente de hidrógeno. Las pruebas y el análisis de AGVs, carbonatos, DQO y TRH proporcionan información sobre la actividad bacteriana que impulsa la producción de hidrógeno. Los principales AGVs producidos fueron ácidos acético, propiónico y butírico. DF1 y DF2 generaron principalmente ácido acético, consistente con fermentaciones basadas en suero de queso (SC). DF1.1, utilizando SC diluido 5x y una relación de inóculo a sustrato (I2SR) de 30:70, mostró niveles elevados de ácido butírico, similares a los observados con residuos de alimentos. El primer proceso de fermentación oscura (DF1) mostró inicialmente un metabolismo efectivo de carbohidratos, pero luego experimentó picos en ácidos succínico y láctico, lo que redujo la producción de hidrógeno. En contraste, el segundo proceso de fermentación oscura (DF2) mantuvo bajos niveles de ácido láctico y aumentó las concentraciones de acetato, lo que indica una mejora en el rendimiento del sistema. DF1.1 también demostró una producción estable de AGVs y reducción del ácido láctico. Una mayor dilución de SC, un pH inicial más alto y un aumento del TRH fueron factores clave para minimizar la acidificación y mejorar las vías de producción de hidrógeno.