Las técnicas de producción de gas in vitro (IVGPT) se utilizan ampliamente para evaluar piensos y aditivos alimentarios con el fin de reducir el número de animales necesarios para los experimentos, lo que a su vez reduce costos y aumenta el bienestar animal. Sin embargo, la información sobre la repetibilidad es escasa. El objetivo de este estudio fue evaluar la variación de las fermentaciones de producción de gas in vitro en el mismo laboratorio utilizando el mismo sustrato alimenticio. La fuente de líquido ruminal utilizada en las fermentaciones fue de dos granjas diferentes con vacas lecheras en lactancia canuladas o novillas canuladas en ayuno, representando dos etapas distintas de producción (tipos de donantes). Se utilizaron diecisiete fermentaciones de 24 h, realizadas durante un año, para evaluar la variación entre los siguientes parámetros: parámetros de la curva de gas, producción total de gas corregida por línea base (TGP (mL a Temperatura y Presión Estándar (STP))/g de materia seca (MS) incubada), concentración de metano (%) y rendimiento (mL de gas a STP/g de MS), pH y materia seca degradada (dMS). Se encontraron diferencias significativas entre los tipos de donantes para el pH del líquido ruminal de animales individuales y el pH del líquido fermentado. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas dentro del tipo de donante. Las medias para la concentración de metano y el rendimiento, después de 24 h de fermentación, no fueron significativamente diferentes entre o dentro de los tipos de donantes. La tasa de producción temprana de gas fue significativamente diferente entre los tipos de donantes, pero la TGP corregida por línea base no fue significativamente diferente a las 24 h. No se detectaron diferencias en dMS después de 24 h de fermentación entre o dentro de los tipos de donantes. Las curvas de producción de gas fueron diferentes entre los tipos de donantes, siendo una versión monopásica del modelo sigmoidal o una curva exponencial para las novillas y los animales de producción, respectivamente. No se observaron diferencias dentro del tipo. La repetibilidad del líquido ruminal (CV), calculada como el coeficiente de variación, y los parámetros asociados que se investigaron, fue mejor para el rendimiento de metano (CV = 0.3%) y menor para la TGP a las 3 h (CV = 3%). La repetibilidad dependía del tipo de donante.