La malaria aviar y la leucocitozoonosis pueden causar enfermedades fatales, mientras que la tripanosomiasis aviar se informa que es inofensiva en las gallinas. Las gallinas de traspatio pueden estar infectadas por varios patógenos, incluidos los parásitos sanguíneos, que pueden afectar la producción avícola industrial, con un impacto económico consecuentemente mayor. Este estudio tuvo como objetivo investigar la presencia de varios parásitos sanguíneos en gallinas de traspatio criadas en el sur de Tailandia, utilizando métodos de detección basados en PCR y microscópicos. Desde junio de 2021 hasta junio de 2022, se muestrearon 57 gallinas de traspatio. Se prepararon frotis de sangre delgada frescos de 11 individuos, y se prepararon frotis de capa leucocitaria de 55 de ellos. Tanto los frotis de sangre delgada como los frotis de capa leucocitaria se utilizaron para el análisis microscópico. Se utilizaron dos protocolos de PCR anidada que amplifican un fragmento de citocromo y genes de rRNA de subunidad pequeña para identificar Haemosporida y parásitos, respectivamente. El número de muestras positivas fue mayor con la aplicación de PCR anidada que cuando se utilizaron frotis de capa leucocitaria. Se encontraron tres nuevas linajes (GALLUS47-49) y trece linajes (GALLUS50-62). Se encontraron trofozoítos, merontes y gametocitos de un linaje en un frotis de sangre delgada. Todos los frotis de sangre delgada revelaron infecciones, pero solo tres muestras presentaron una infección única. Estas tres muestras revelaron la presencia de complejos de células huésped-parásito fusiformes, cuyas características morfológicas se asemejaban a las de otro parásito, mientras que se mostró que este parásito está estrechamente relacionado con el linaje GALLUS06-07, descrito como otro parásito. La prevalencia fue del 33.33%; estuvo presente en solo uno de los frotis de sangre delgada, y se asemeja a otro parásito. Este estudio mostró la prevalencia de una alta diversidad de parásitos en gallinas tailandesas. Tanto la PCR anidada como el frotis de capa leucocitaria pueden usarse como herramienta de diagnóstico para la detección de parásitos y para el control parasitario en gallinas de traspatio y granjas avícolas. La información sobre las especies de parásitos que se pueden encontrar en gallinas criadas en el sur de Tailandia también se consideró como información básica para futuros estudios.