La propagación vegetativa de angiospermas acuáticas, la familia Lemnaceae (lentejas de agua) representa recursos genéticos valiosos para la bioeconomía circular y otras aplicaciones sostenibles. Debido a su crecimiento extremadamente rápido y a la laboriosa cultivación de colecciones in vitro, las lentejas de agua son un tema urgente para la criopreservación. Desarrollamos un protocolo robusto y rápido sin DMSO para la criopreservación de lentejas de agua mediante vitrificación. Se diseñó un dispositivo de un solo uso para muestrear frondas de lentejas de agua de la cultura donante, secado por centrifugación y posterior transferencia a tubos criogénicos con solución de vitrificación de plantas 3 (PVS3). Tras la cultivación en la oscuridad y la aplicación de temperaturas elevadas durante la etapa temprana de re-crecimiento, una iluminación pulsada específica en lugar de un régimen diurno permitió un re-crecimiento exitoso después de la criopreservación de 21 accesiones de los géneros , , , e incluyendo híbridos interespecíficos, auto- y alopoliploides. Las mediciones del tamaño del genoma no revelaron cambios genómicos cuantitativos potencialmente causados por la criopreservación. La expresión de genes, considerados como factores clave en el desarrollo de la tolerancia a la congelación, se estudió antes del enfriamiento pero no se vinculó con el re-crecimiento de las lentejas de agua después del recalentamiento. A pesar de preservar la fluorescencia de clorofila después del recalentamiento, las frondas recalentadas demostraron casi cero actividad fotosintética, que no se recuperó. El nuevo protocolo proporciona la base para la futura aplicación rutinaria de crioconservación a colecciones de germoplasma de lentejas de agua, ahorrando mano de obra para la cultivación in vitro y manteniendo muestras de referencia y mutantes caracterizadas.