Las células de Leydig (CL) en los testículos producen la hormona sexual masculina testosterona (T). Se sabe que varios xenobióticos, incluidos medicamentos clínicos, suplementos y productos químicos ambientales, alteran la homeostasis de T. Notablemente, se conoce que algunos de estos xenobióticos activan el receptor X de pregnano (PXR), un receptor nuclear dependiente de ligandos. Sin embargo, actualmente se desconoce si el PXR se expresa en las CL y si la activación del PXR altera la síntesis de T en las CL de roedores. Por lo tanto, en este estudio, buscamos determinar si el PXR se expresa en las CL de roedores y si el carbonitrilo de pregnenolona 16-alfa (PCN), el agonista prototipo del PXR de roedores, regula la biosíntesis de T en las CL de roedores. Se realizaron análisis hormonales, así como de expresión de proteínas y genes en CL primarias de ratas y células de Leydig MA-10 de ratón. Los resultados mostraron que el PXR se expresó a nivel de ARNm y proteína tanto en las CL primarias de ratas como en las células MA-10. La incubación de CL primarias de ratas con PCN resultó en una disminución significativa en la secreción de T. Esta disminución en la secreción de T inducida por PCN se asoció con una disminución en la expresión de proteínas de enzimas esteroidogénicas clave como 3beta-HSD y CYP17A1. Los resultados de RNA-seq de las células MA-10 mostraron que el PCN reguló a la baja los transcritos de enzimas esteroidogénicas y proteínas involucradas en la vía de síntesis de T. En conjunto, estos resultados sugieren que el PCN, un agonista del PXR de roedores, puede regular la biosíntesis de T en las CL de roedores al regular a la baja la expresión de las enzimas esteroidogénicas involucradas en la biosíntesis de T. Nuestros resultados son significativos ya que proporcionan un posible nuevo mecanismo para la alteración de la homeostasis de testosterona por una variedad de xenobióticos.