El semen criopreservado se utiliza extensamente en la inseminación artificial (IA) de animales domésticos; sin embargo, las tasas de concepción subóptimas debido al daño oxidativo tras la IA continúan siendo un desafío. El presente estudio investigó los efectos de la Quinona Pirroloquinolina (PQQ), un nuevo antioxidante, sobre la calidad del semen de toros Holstein durante la criopreservación, así como sus posibles mecanismos moleculares. Las muestras de semen se diluyeron con diferentes concentraciones de PQQ (0, 50 mol/L, 100 mol/L, 150 mol/L) antes de la criopreservación. Tras el proceso de congelación-descongelación, se realizó una evaluación exhaustiva para evaluar la motilidad espermática, la integridad de la membrana plasmática, la integridad del acrosoma y los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS), malondialdehído (MDA) y trifosfato de adenosina (ATP). Se empleó análisis de Western blot para examinar los niveles de proteínas como PGAM2, CAPZB, CAT, SOD1 y GPX1. Notablemente, la inclusión de 100 mol/L de PQQ mejoró significativamente la motilidad espermática, la integridad de la membrana y la integridad del acrosoma después de la congelación-descongelación (< 0.05). Además, el grupo tratado con 100 mol/L de PQQ mostró niveles reducidos de MDA y ROS (< 0.05), mientras que los niveles de ATP se elevaron significativamente (< 0.05). Curiosamente, el tratamiento con 100 mol/L de PQQ resultó en una disminución del consumo de las proteínas PGAM2, CAPZB, CAT, SOD1 y GPX1 en los espermatozoides después de la congelación-descongelación, en comparación con el grupo de control (< 0.05). Estos hallazgos indican que el tratamiento con PQQ mejora la calidad del semen de toros, mitiga el daño por estrés oxidativo y, en última instancia, mejora la eficacia de la criopreservación de espermatozoides.