Aunque CRISPR/Cas9 se ha utilizado en la manipulación genética de varias especies de peces in vivo, su aplicación en células de peces cultivadas sigue siendo un desafío y está limitada. En este estudio, establecimos un sistema de plásmido CRISPR/Cas9 integrado y evaluamos su eficiencia de eliminación o inserción de genes en un sitio específico en medaka (Oryzias latipes) in vitro e in vivo. Al utilizar el plásmido reportero de proteína fluorescente verde mejorada pGNtsf1, demostramos que pCas9-U6sgRNA impulsado por el promotor U6 endógeno (pCas9-mU6sgRNA) mediaba una eficiencia de edición genética muy alta en células cultivadas de medaka, pero no por promotores U6 exógenos. Después de optimizar las condiciones, se calcularon las eficiencias de edición genética de ocho sitios dirigidos a cuatro genes endógenos, y la más alta fue de hasta el 94% sin off-target detectable. Mediante microinyección de embrión de una célula, pCas9-mU6sgRNA también mediaba una eficiente eliminación de genes in vivo. Además, pCas9-mU6sgRNA mediaba eficientemente la inserción de genes en un sitio específico en células cultivadas de medaka, así como en embriones. En conjunto, nuestro estudio demuestra que la relación genética del promotor U6 es crítica para la eficiencia de edición genética en células cultivadas de medaka, y se ha establecido un sistema simple y eficiente para la edición del genoma de medaka in vitro e in vivo. Este estudio proporciona una visión sobre la edición del genoma de otros peces y promueve el análisis funcional de genes.