La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) multiplex de loci de microsatélites permite la amplificación simultánea de dos o más pares de cebadores en una sola reacción de PCR; por lo tanto, es rentable y eficiente en tiempo. Sin embargo, se han reportado muy pocos intentos en especies no modelo. En este estudio, al combinar un enfoque de desarrollo de novo basado en el genoma y una aplicación entre especies, se probó un sistema de PCR multiplex que comprende 5 reacciones de PCR de 33 microsatélites, consistentes en 26 loci genómicos novedosos y 7 loci obtenidos de la literatura, para evaluar polimorfismos, transferibilidad entre especies y la capacidad de evaluar la diversidad genética y la estructura poblacional de tres especies de nuez ( spp.). Encontramos que el enfoque basado en el genoma es más eficiente que otros métodos. Se desarrolló una escalera alélica para cada locus para mejorar la genotipificación consistente entre laboratorios. Los resultados del análisis genético poblacional mostraron que los 33 loci se transfirieron con éxito entre las tres especies, mostrando un alto polimorfismo y una fuerte estructura genética. Por lo tanto, el sistema de PCR multiplex es altamente aplicable en especies de nuez. Además, proponemos un pipeline eficiente para caracterizar y genotipar loci de microsatélites polimórficos. La nueva caja de herramientas desarrollada aquí ayudará a futuros estudios de ecología y evolución en nueces y podría servir como modelo para otras especies de plantas.