Las enfermedades sistémicas de los cítricos, incluido el Huanglongbing de los cítricos (causado por Liberibacter asiaticus (Las)), la tristeza de los cítricos (causada por el virus de la tristeza de los cítricos (CTV)), la hoja de papel de los cítricos (causada por el virus de la hoja de papel de los cítricos (CTLV)) y la exocortis de los cítricos (causada por el viroide de la exocortis de los cítricos (CEVd)), representan amenazas para la producción de cítricos en Taiwán. Los métodos de diagnóstico confiables son importantes para la gestión de estas enfermedades sistémicas. En este estudio, desarrollamos un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa multiplex de transcripción inversa (RT-PCR) para detectar cuatro patógenos simultáneamente. Los amplicones específicos de cada patógeno (295 pb para Las, 468 pb para CTV, 120 pb para CTLV y 196 pb para CEVd) se produjeron con éxito utilizando el multiplex RT-PCR optimizado descrito aquí. La evaluación de la sensibilidad mostró que se pueden detectar bajas concentraciones de patógenos utilizando este multiplex RT-PCR. En comparación con los ensayos simplex publicados, la detección de muestras de campo utilizando el multiplex RT-PCR desarrollado en este estudio mostró un mejor rendimiento. Las detecciones mediante multiplex RT-PCR revelaron que estos cuatro patógenos sistémicos de los cítricos se encuentran comúnmente en los campos, y el 30.0% de las muestras de campo estaban infectadas por una mezcla de patógenos. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio de una encuesta de las cuatro importantes enfermedades sistémicas de los cítricos en Taiwán, y proporciona información para mejorar la gestión de enfermedades. Por lo tanto, el ensayo de multiplex RT-PCR proporciona un método útil para el monitoreo rutinario de enfermedades y la producción de plantas cítricas libres de patógenos.