Las infecciones con (EHP), el virus de necrosis hipodérmica e hematopoyética infecciosa (IHHNV) y el virus iridiscente de decápodos 1 (DIV1) representan desafíos significativos para la industria del camarón. Aquí, se estableció un ensayo de PCR en tiempo real triple basado en la curva de fusión y en el colorante fluorescente Eva Green para la detección simultánea de EHP, IHHNV y DIV1. El ensayo mostró alta especificidad, sensibilidad y reproducibilidad. Se evaluaron un total de 190 muestras clínicas de las provincias de Shandong, Jiangsu, Sichuan, Guangdong y Hainan en China mediante el ensayo de PCR en tiempo real triple Eva Green. Las tasas de positividad de EHP, IHHNV y DIV1 fueron del 10.5%, 18.9% y 44.2%, respectivamente. Las muestras también se evaluaron mediante ensayos de qPCR TaqMan para EHP, DIV1 e IHHNV, y la tasa de concordancia fue del 100%. Esto ilustró que el nuevo ensayo de PCR en tiempo real triple Eva Green desarrollado puede proporcionar un método preciso para la detección simultánea de tres patógenos del camarón.