Las pastas dentales que contienen nano-hidroxiapatita (n-HAp) sustituida por iones metálicos proporcionan iones de calcio y fosfato a los tejidos duros dentales, reduciendo la desmineralización y promoviendo la remineralización. Hay pocos datos disponibles sobre el efecto de estos compuestos bioactivos en la microbiota oral. Este estudio in vitro evaluó la influencia de dos pastas dentales comerciales a base de n-HAp sustituido (alfa: n-HAp sustituido por carbonato de Zn; beta: n-HAp sustituido por carbonato de F, Mg, Sr) en la colonización temprana (EC, 12 h) y la formación de biofilm (BF, 24 h) por la microbiota oral. Los controles se cepillaron con agua destilada. Se desarrollaron microcosmos orales artificiales y biofilms utilizando esmalte humano y un compuesto basado en resina (RBC) como superficies de adherencia. Se utilizaron dos configuraciones de prueba, una placa multi-pozo agitada y un reactor de flujo por goteo modificado (MDFR), para simular condiciones clínicas durante la noche (bajo flujo salival y clearance) y durante el día, respectivamente. Se utilizó espectrometría de rayos X dispersiva por energía (EDS) para evaluar las superficies de las muestras después del tratamiento con pasta dental. Se evaluó la liberación de fluoruro de la pasta dental beta. La biomasa adherente viable se cuantificó mediante el ensayo MTT, y la morfología de los biofilms se destacó utilizando microscopía confocal. EDS mostró la presencia de restos de las pastas dentales probadas en ambas superficies de adherencia. La pasta dental beta mostró significativamente menor EC y BF en comparación con el control utilizando el modelo de microcosmos oral artificial, mientras que la pasta dental alfa mostró menor EC y BF en comparación con el control, pero mayor EC y BF en comparación con la pasta dental beta. El efecto mostrado por la pasta dental beta fue, en mínima medida, debido a la liberación de fluoruro. Curiosamente, este resultado se observó en ambas superficies de adherencia, lo que significa que las pastas dentales probadas influyeron significativamente en EC y BF incluso en superficies de RBC. Además, el efecto de los tratamientos con pasta dental fue mayor después de 12 h que después de 24 h, sugiriendo que cepillarse los dientes dos veces al día es más efectivo que cepillarse una vez. La eficacia de estos tratamientos en la reducción de la colonización microbiana de las superficies de RBC puede representar una posibilidad prometedora en la prevención de caries secundarias.