Hay una creciente demanda industrial de recursos sostenibles para la producción de biocombustibles a base de lípidos y productos químicos de plataforma. Un recurso prometedor y eficiente en CO es la microalga cultivada autotróficamente, ya sea para la producción directa de aceite de células individuales (SCO) o como sustrato de biomasa para la producción fermentativa de SCO a través de organismos como las levaduras. En cuanto a esto último, la hidrólisis química de la biomasa suele resultar en un alto rendimiento de azúcares y altas concentraciones de sal debido a la neutralización requerida antes de la fermentación. En contraste, la hidrólisis enzimática a menudo carece de eficiencia en masa. En este estudio, se optimizó la hidrólisis enzimática de biomasa autotrófica tanto rica en nutrientes como en lípidos, probando diferentes pretratamientos y actividades enzimáticas. Así, se identificó que el tratamiento con proteasas para debilitar la integridad de la pared celular y la dosificación de Cellic CTec3 tenían el mayor efecto en la eficiencia de hidrólisis. Se pudieron alcanzar rendimientos de azúcares del 63% (rica en nutrientes) y casi del 100% (rica en lípidos). El proceso se escaló con éxito en mini biorreactores a una escala de 250 mL. El hidrolizado resultante de la biomasa rica en lípidos se probó como sustrato de la levadura oleaginosa en un sistema de alimentación por lotes basado en el consumo de ácido acético. Superó tanto al sustrato modelo como al control de glucosa, demostrando el alto potencial del hidrolizado como materia prima para la producción de aceite de levadura. La cadena de valor secuencial y circular presentada para la producción de SCO destaca el potencial para la producción de biocombustibles eficiente en masa y en espacio-tiempo, combinando el cultivo autotrófico de algas oleaginosas con la fermentación de aceite de levadura desacoplada por primera vez.