El cultivo celular basado en microportadores es un método comúnmente utilizado para facilitar el crecimiento de células dependientes de anclaje como MA 104 para la fabricación de antígenos. Sin embargo, convencionalmente, se emplea el cultivo celular estático para la propagación celular antes de sembrar el biorreactor de producción con microportadores (MCs). Este estudio demuestra la efectiva sustitución del método convencional mediante el subcultivo en serie en MCs con desprendimiento celular in situ bajo condiciones óptimas en unidades de cultivo cerradas. Este estudio demuestra que MA 104 puede ser subcultivado al menos cinco veces en MC Cytodex 1 sin necesidad de separar células y MC después de la recolección celular. Se estudiaron los parámetros del proceso que impactan en el crecimiento celular después del desprendimiento celular in situ en un modelo a escala reducida. La optimización, utilizando un Diseño de Experimentos (DoE) aumentado combinado con modelado híbrido, facilitó la rápida selección del espacio de diseño para los parámetros críticos del proceso (CPPs). Las condiciones optimizadas incluyeron una densidad de inoculación de >16 células/perla, 3.5-4.5 g/L de Cytodex 1, y una velocidad de agitación controlada, comenzando en N (velocidad mínima de agitación) durante el primer día con un aumento máximo del 25% posteriormente. Con estos espacios de diseño para CPPs, se logró una densidad celular de 2.6 +/- 0.5 x 10 células/mL después de cinco días. Esta metodología de bioproceso refinada ofrece un enfoque confiable y eficiente para el entrenamiento de semillas en reactores de tanque agitado, lo cual es particularmente beneficioso para la producción de vacunas virales.