La cultura de óvulos in vitro sirve como una plataforma experimental para explorar los procesos de crecimiento y desarrollo de las fibras de algodón. Sin embargo, a lo largo de las décadas, la investigación sobre la cultura de óvulos in vitro del algodón de tierras altas ha permanecido subdesarrollada. En este estudio, se utilizaron óvulos recolectados 2 días después de la anthesis (2 DPA) de la línea genética estándar TM-1 del algodón de tierras altas para investigar los efectos de las fuentes de carbono (glucosa, fructosa, sacarosa), kinetina (KT) y glutamina (Gln) en el crecimiento de los óvulos y el desarrollo de fibras observadas in vitro. Los resultados mostraron que los óvulos crecieron más favorablemente en un medio suplementado con 0.05 M de glucosa, 0.02 M de fructosa y sus productos de degradación como fuentes de carbono. En cuanto al papel de la KT, tiene un ligero efecto inhibitorio en el desarrollo de la fibra de algodón in vitro a una concentración más baja (0.1 mg/L). Sin embargo, a medida que la concentración aumentó (0.5 mg/L), su efecto cambió a promoción. Además, la Gln demostró la capacidad de mejorar las características de esponjosidad de la fibra. En este estudio, se estableció la fórmula optimizada para la cultura de óvulos in vitro del algodón de tierras altas. Este método proporciona un sistema técnico mejorado para la cultura de óvulos in vitro del algodón de tierras altas, con un gran potencial para la genómica de funciones de fibra y la bioingeniería de semillas en el algodón.