La condición de la muestra es un factor importante en la proteómica de la orina con estabilidad y precisión. Sin embargo, aún no se ha establecido un protocolo general de preparación de proteínas de orina en el análisis de espectrometría de masas. Aquí, proponemos un flujo de trabajo para la preparación de muestras optimizada basada en la precipitación de metanol/cloroformo (M/C) y la digestión de tripsina en solución en proteómica de orina basada en LC-MS/MS. Las proteínas de la orina preparadas por precipitación de M/C mostraron alrededor del 80% de la tasa de recuperación de proteínas. Las muestras mostraron el mayor número de proteínas identificadas, que superaban las 1000 en promedio en comparación con otros métodos de precipitación en proteómica de orina basada en LC-MS/MS. Para mejorar aún más el flujo de trabajo, las esencias se organizaron en la disolución de proteínas y el paso de digestión de tripsina para la extracción de proteínas de orina. La adición de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) mejoró drásticamente la disolución de proteínas y promovió la actividad de tripsina en el paso de digestión, ya que el tratamiento aumentó el número de proteínas identificadas con menos sitios de clivaje perdidos. Finalmente, se estableció un flujo de trabajo optimizado mediante una estrategia bien organizada para su uso diario en la proteómica de orina basada en LC-MS/MS. El flujo de trabajo será de gran ayuda para varios objetivos basados en enfoques de proteómica de orina, como diagnóstico y descubrimiento de biomarcadores.