El virus de la hepatitis murina (MHV) es un betacoronavirus patógeno no humano que está relacionado evolutiva y estructuralmente con los virus patógenos humanos SARS-CoV, MERS-CoV y SARS-CoV-2. Sin embargo, a diferencia de los virus humanos SARS y MERS, MHV requiere un laboratorio de nivel de bioseguridad 2 para su propagación y manejo seguro, lo que lo convierte en un virus sustituto potencialmente adecuado. A pesar de esta utilidad, pocos artículos han discutido la propagación y cuantificación de MHV utilizando líneas celulares fácilmente disponibles en biorepositorios, lo que hace que su implementación no sea fácilmente reproducible. Este artículo proporciona protocolos para la propagación y cuantificación de MHV-A59 utilizando las líneas celulares recomendadas NCTC clon 1469 y clon 929 de American Type Culture Collection (ATCC). Específicamente, los métodos detallan la reactivación de células, el pasaje rutinario de células, la preparación de stocks congelados, la infección de NCTC clon 1469 con MHV y la cosecha subsiguiente, y la cuantificación de MHV mediante ensayo de placas utilizando células NCTC clon 929. Utilizando estos protocolos, un laboratorio de BSL-2 equipado para trabajo con cultivos celulares generaría al menos 6,0 unidades formadoras de placas (UFP) por mL de lisado de MHV y proporcionaría un ensayo de superposición optimizado utilizando metilcelulosa o agarosa como superposiciones para la titulación de partículas virales infecciosas. Los protocolos descritos aquí están destinados a ser utilizados para estudios de persistencia e inactivación de coronavirus.