Optimización de la extracción de ADN genómico de insectos para secuenciación de lecturas largas
Autores: Oppert, Brenda; Stoss, Samantha; Monk, Alaysha; Smith, Timothy
Idioma: Inglés
Editor: MDPI
Año: 2019
Acceso abierto
Artículo científico
2019
Optimización de la extracción de ADN genómico de insectos para secuenciación de lecturas largas
Categoría
Ingeniería y Tecnología
Subcategoría
Bioingeniería
Palabras clave
Secuenciación de larga lectura
Extracción de ADN genómico
Insectos
Etapa de pupa
Alta calidad
Procedimientos modificados.
Licencia
CC BY-SA – Atribución – Compartir Igual
Consultas: 25
Citaciones: Sin citaciones
Las tecnologías de secuenciación de largas lecturas continúan aumentando la longitud de las lecturas, y en la actualidad pueden tener longitudes promedio de lectura de >20 kb hasta 60-80 kb. Ahora el desafío es extraer ADN genómico de tamaño de fragmento y calidad suficientes para soportar longitudes de lectura más largas. Desarrollamos un método exitoso para obtener de manera consistente ADN genómico largo de alta calidad de insectos. Se determinó que la etapa de desarrollo óptima de los insectos para la extracción de ADN genómico era la etapa de pupa, eliminando el ADN de los alimentos ingeridos y reduciendo la contaminación por material quitinoso que puede interferir con la extracción. Se obtuvieron resultados mejorados mediante un procedimiento modificado de un kit comercial de extracción de ADN genómico. Inicialmente, el tejido pupal blando del escarabajo de la harina roja fue interrumpido en el tampón de lisis del kit utilizando micropestilos de teflón. Las modificaciones al protocolo del kit también incluyeron una mezcla suave por inversión del tubo, en lugar de pasos de agitación brusca, y el uso de puntas de pipeta de diámetro ancho para transferir fracciones que contienen ADN genómico. Se proporcionaron datos de una muestra como ejemplo de una exitosa producción de biblioteca y secuenciación aguas abajo. Aunque la técnica ha sido optimizada para insectos, las extracciones de tejidos de otros organismos utilizando estos procedimientos modificados también pueden mejorar los resultados de secuenciación de largas lecturas.
Descripción
Las tecnologías de secuenciación de largas lecturas continúan aumentando la longitud de las lecturas, y en la actualidad pueden tener longitudes promedio de lectura de >20 kb hasta 60-80 kb. Ahora el desafío es extraer ADN genómico de tamaño de fragmento y calidad suficientes para soportar longitudes de lectura más largas. Desarrollamos un método exitoso para obtener de manera consistente ADN genómico largo de alta calidad de insectos. Se determinó que la etapa de desarrollo óptima de los insectos para la extracción de ADN genómico era la etapa de pupa, eliminando el ADN de los alimentos ingeridos y reduciendo la contaminación por material quitinoso que puede interferir con la extracción. Se obtuvieron resultados mejorados mediante un procedimiento modificado de un kit comercial de extracción de ADN genómico. Inicialmente, el tejido pupal blando del escarabajo de la harina roja fue interrumpido en el tampón de lisis del kit utilizando micropestilos de teflón. Las modificaciones al protocolo del kit también incluyeron una mezcla suave por inversión del tubo, en lugar de pasos de agitación brusca, y el uso de puntas de pipeta de diámetro ancho para transferir fracciones que contienen ADN genómico. Se proporcionaron datos de una muestra como ejemplo de una exitosa producción de biblioteca y secuenciación aguas abajo. Aunque la técnica ha sido optimizada para insectos, las extracciones de tejidos de otros organismos utilizando estos procedimientos modificados también pueden mejorar los resultados de secuenciación de largas lecturas.