El objetivo de este estudio fue verificar si las pequeñas moléculas pueden mejorar la eficiencia de la edición genética de precisión utilizando repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) ribonucleoproteínas (RNP) en células porcinas. Se utilizaron la proteína asociada a CRISPR 9 (Cas9), ARN guía pequeño (sgRNA), oligonucleótidos de cadena sencilla modificados con fosforotioato (ssODN) y diferentes pequeñas moléculas para generar sustituciones nucleotídicas precisas en el gen de insulina (INS) mediante reparación dirigida por homología (HDR) en fibroblastos fetales porcinos (PFFs). Estos componentes se introdujeron en los PFFs mediante electroporación, seguida de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el sitio objetivo. Todas las muestras fueron secuenciadas y analizadas, y se compararon las eficiencias de diferentes pequeñas moléculas en el sitio objetivo. Los resultados mostraron que se determinaron las concentraciones óptimas de las pequeñas moléculas, incluyendo L-189, NU7441, SCR7, L755507, RS-1 y Brefeldina A, para la viabilidad de los PFFs cultivados in vitro. En comparación con el grupo de control, las pequeñas moléculas individuales, incluyendo L-189, NU7441, SCR7, L755507, RS-1 y Brefeldina A, aumentaron la eficiencia de la edición genética precisa mediada por HDR de 1.71 a 2.28 veces, respectivamente. No hay beneficios en el uso de la combinación de dos pequeñas moléculas, ya que ninguna de las combinaciones mejoró la eficiencia de la edición genética precisa en comparación con las pequeñas moléculas individuales. En conclusión, estos resultados sugieren que una sola pequeña molécula puede aumentar la eficiencia de la edición genética precisa mediada por CRISPR RNP en células porcinas.