Con el avance de la biología sintética, el sistema de síntesis de proteínas sin células (CFPS) ha estado recibiendo la atención como un conjunto de herramientas versátil para la ingeniería de sistemas biológicos naturales y no naturales. El sistema CFPS reensambla los materiales necesarios para la transcripción y traducción y recrea el entorno de síntesis de proteínas in vitro al escapar de un límite físico vivo. El extracto celular juega un papel esencial en este formato in vitro. Aquí, proponemos un protocolo y método práctico para la preparación y optimización del extracto celular derivado, que puede aplicarse fácilmente tanto a cepas disponibles comercialmente como a cepas genéticamente modificadas. El protocolo incluye: (1) El paso de preparación para el crecimiento y recolección celular, (2) los procedimientos detallados paso a paso para la preparación del extracto celular, incluyendo el lavado y lisis celular, centrifugación, reacción de escape y diálisis, (3) la preparación de los componentes de reacción CFPS y, (4) la cuantificación del extracto celular y la proteína sintetizada sin células. Anticipamos que el protocolo en esta investigación proporcionará un procedimiento simple de preparación y optimización de un extracto celular altamente activo.