En los últimos años, los métodos de secuenciación de alto rendimiento se han vuelto cada vez más populares en los laboratorios de biología molecular, principalmente debido al costo relativamente bajo de las plataformas pequeñas de sobremesa, la simplicidad de la preparación de bibliotecas y el bajo precio por unidad de información. La secuenciación de genomas enormes y complejos, como los genomas de cereales, sigue siendo un desafío y no siempre es necesario. Por lo tanto, se han desarrollado varias técnicas para secuenciar una representación reducida del genoma. La más flexible y ampliamente utilizada de estas es ddRAD-Seq, que utiliza un par de enzimas de restricción para generar un pool de fragmentos de ADN. El objetivo de este estudio fue validar in vitro la eficacia de diferentes combinaciones de enzimas de restricción para la construcción de bibliotecas ddRAD-Seq en cebada y maíz. Once pares de enzimas de restricción fueron seleccionados y probados para determinar las concentraciones de fragmentos con el rango de longitud esperado y seleccionar los pares adecuados para muestrear los genomas de estos dos cereales utilizando ddRAD-Seq. Para los pares seleccionados, es decir, PstI-MspI y HindIII-FspBI para cebada y maíz, respectivamente, se prepararon bibliotecas para la secuenciación de NGS en Illumina MiSeq. La secuenciación confirmó la idoneidad de las enzimas seleccionadas para realizar ddRAD-Seq en diferentes genotipos. Los resultados presentados pueden ser utilizados para investigaciones extensas sobre estas importantes especies de cereales.