La prevalencia y gravedad del cáncer de piel, específicamente el melanoma maligno, entre los caucásicos sigue siendo una preocupación significativa. Los compuestos naturales de las plantas han sido explorados durante mucho tiempo como posibles agentes anticancerígenos. El ácido betulínico (BI) ha mostrado promesas en sus propiedades terapéuticas, incluidos sus efectos anticancerígenos. Sin embargo, su limitada biodisponibilidad ha obstaculizado sus aplicaciones medicinales. Para abordar este problema, se compararon dos derivados semisintéticos recientemente sintetizados, -(2,3-indolo-betulinoyl)diglycylglycine (BA1) y -(2,3-indolo-betulinoyl)glycylglycine (BA2), con compuestos previamente reportados -(2,3-indolo-betulinoyl)glycine (BA3), 2,3-indolo-ácido betulínico (BA4) y BI. Estos compuestos fueron evaluados por sus efectos en células de melanoma murino (B164A5) utilizando varios ensayos in vitro. La introducción de un marco indol en la posición C2 de BI resultó en una mayor citotoxicidad. Además, la citotoxicidad del compuesto BA4 se mejoró al conjugar su grupo carboxílico con un residuo de aminoácido. BA2 y BA3, con residuos de glicina y glicilglicina en C28, exhibieron aproximadamente 2.20 veces más actividad inhibitoria en comparación con BA4. La evaluación de seguridad de los compuestos en queratinocitos humanos (HaCaT) ha revelado que concentraciones de hasta 10 uM redujeron ligeramente la viabilidad celular, mientras que concentraciones de 75 uM resultaron en tasas de viabilidad celular más bajas. Los ensayos de fuga de LDH confirmaron daño en la membrana celular en células B164A5 cuando se expusieron a los compuestos probados. BA2 y BA3 exhibieron la mayor liberación de LDH, lo que indica su fuerte citotoxicidad. El ensayo NR reveló una disrupción lisosómica dependiente de la dosis para BI y los derivados del ácido 2,3-indolo-betulínico, con BA1, BA2 y BA3 mostrando los efectos citotóxicos más fuertes. Los ensayos de raspado demostraron una inhibición dependiente de la concentración de la migración celular, siendo BA2 y BA3 los más efectivos. La tinción con Hoechst 3342 reveló que BA2 inducía apoptosis, mientras que BA3 inducía necrosis a concentraciones más bajas, confirmando sus propiedades anti-melanoma. En conclusión, los derivados semisintéticos de BI, particularmente BA2 y BA3, muestran promesas como posibles candidatos para una investigación adicional en el desarrollo de terapias anticancerígenas efectivas.