Los riñones son fundamentales para la homeostasis, pero son susceptibles a compuestos nefrotóxicos. Las células epiteliales tubulares proximales (PTECs) median el metabolismo y el transporte de fármacos y se utilizan ampliamente en estudios preclínicos. Sin embargo, las PTECs comerciales son limitadas en disponibilidad y relevancia fisiológica. Este estudio tuvo como objetivo desarrollar un protocolo novedoso y confiable para aislar y cultivar PTECs a partir de biopsias renales humanas. Se aislaron PTECs primarias de biopsias renales de dos pacientes (MFUM-RPTEC-1 y MFUM-RPTEC-2). Se evaluaron su morfología, tiempo de duplicación poblacional, resistencia eléctrica transepitelial (TEER) y marcadores fenotípicos. La polarización y la expresión de transportadores se analizaron utilizando células cultivadas en insertos Transwell. Las colonias se formaron en 24-48 h, alcanzando la confluencia en 8-10 días y la formación de domos (hemicistos) en el día 13. Los valores de TEER alcanzaron un máximo de 190 Ohm/cm después de 7-14 días, confirmando la formación de uniones estrechas. La inmunotinción identificó marcadores característicos (por ejemplo, SGLT2, OAT1/3, OCT2, P-gp, MRP4, MATE1, N-cadherina, ZO-1, CK-18). Las células cultivadas en placas Transwell exhibieron polarización nativa, expresando transportadores cruciales para la excreción de fármacos en las superficies apical y basolateral. Presentamos dos protocolos robustos para aislar y caracterizar PTECs, ofreciendo un método escalable para obtener células funcionales y polarizadas a partir de material de biopsia escaso. Por lo tanto, las PTECs aisladas representan una plataforma valiosa para estudios preclínicos, especialmente para pruebas de excreción de fármacos a través de los transportadores expresados. La competencia de fármacos por estos transportadores durante la secreción tubular también es una causa común de nefrotoxicidad.