Los promotores actúan como el interruptor de la transcripción génica, desempeñando un papel importante en la regulación de la expresión génica y la producción de metabolitos. Sin embargo, el enfoque para seleccionar promotores constitutivos fuertes en microorganismos sigue siendo limitado. En este estudio, se diseñó un método novedoso para identificar promotores constitutivos fuertes en y basado en la interrupción genómica aleatoria y la tecnología de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Primero, los genomas de , , y fueron interrumpidos aleatoriamente e insertados en la región upstream del gen reportero para construir tres bibliotecas de promotores, y se seleccionó un promotor constitutivo fuerte potencial (P) adecuado para a través de la tecnología FACS. En segundo lugar, se identificó la secuencia del promotor central (P) del promotor seleccionado mediante truncamiento de secuencia. En tercer lugar, se construyó una biblioteca de promotores de P instalando bases degeneradas a través de síntesis química para mejorar aún más su fuerza, y la intensidad del promotor producido P fue 59.56 veces mayor que la del promotor P. Posteriormente, se aplicaron los promotores P_, P, P, P, P y P con diferentes fuerzas para aumentar el flujo metabólico de la síntesis de L-valina, y el rendimiento de L-valina mejoró significativamente. Finalmente, se seleccionó un promotor constitutivo fuerte adecuado para mediante un método similar y se aplicó para aumentar la producción de prodigiosina en un 34.81%. En conjunto, la construcción de una biblioteca de promotores basada en la interrupción genómica aleatoria fue efectiva para seleccionar los promotores constitutivos fuertes para ajustar la expresión génica y reprogramar el flujo metabólico en varios microorganismos.