Varios estudios han demostrado la importancia de la suplementación con vitamina D3 en animales pequeños. En los perros, un bajo estado de vitamina D3 se asocia no solo con el metabolismo óseo, sino también con diferentes tipos de trastornos, como la insuficiencia cardíaca congestiva, enfermedades gastrointestinales, enfermedades renales crónicas y algunos tipos de cáncer. Sin embargo, es crucial mantener el equilibrio y monitorear la introducción de este nutriente esencial a través de la dieta, ya que la sobre-suplencia puede resultar en toxicidad. Debido a la importancia clínica de evaluar el estado de vitamina D3 en pacientes de animales pequeños, se necesita un método analítico rápido, simple y de alto rendimiento para su medición. En este estudio, describimos el desarrollo de un nuevo método de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem para la cuantificación de 25-hidroxivitamina D3 en suero canino. El enfoque fue validado con éxito siguiendo las pautas europeas actuales, demostrando una excelente linealidad (R2 siempre >=0.996), precisión (siempre dentro de +/-13%) y exactitud (siempre).