Antecedentes: El glifosato se ha utilizado extensamente como herbicida desde principios de la década de 1970. El límite de exposición diaria se establece en 0.3 mg/kg de peso corporal/día en Europa y 1.75 mg/kg de peso corporal/día en los EE. UU. Entre sus derivados, el ácido aminometilfosfónico es el más estable y abundante. Comprender sus efectos biológicos requiere métodos fiables para la cuantificación en muestras biológicas. Métodos: Desarrollamos y validamos un método cromatográfico rápido, de bajo costo y fiable para determinar las concentraciones de glifosato y ácido aminometilfosfónico. La validación incluyó los siguientes parámetros: especificidad, selectividad, efecto matriz, exactitud, precisión, rendimiento de calibración, límite de cuantificación, recuperación y estabilidad. La extracción de muestras empleó una resina de intercambio aniónico con elución utilizando ácido clorhídrico 50.0 mmol/L. Para el análisis por HPLC, los analitos fueron derivatizados, separados en una columna C18 con una fase móvil de tampón fosfato (0.20 mol/L, pH 3.0) y acetonitrilo (85:15), y detectados a 240 nm. Resultados: El método demostró alta fiabilidad y reproducibilidad en varias matrices. Su rendimiento cumplió con todos los criterios de validación, confirmando su idoneidad para cuantificar glifosato y ácido aminometilfosfónico en diferentes configuraciones biológicas y experimentales. Conclusiones: Este método puede ofrecer un recurso práctico para aplicaciones en investigación experimental, diagnósticos médicos, control de calidad y seguridad alimentaria.