La desgrasificación de las semillas de cáñamo descascaradas es un paso crucial antes de la extracción de proteínas. Sin embargo, los métodos convencionales dependen de disolventes inflamables, lo que plantea preocupaciones significativas de salud, seguridad y medio ambiente. Además, la proteína de cáñamo tiene una baja extractabilidad, funcionalidad desafiante y limitaciones de sabor, lo que restringe su aplicación más amplia en alimentos. En consecuencia, se evaluó una extracción asistida por un disolvente eutéctico profundo natural (NADES) de dos fases como una alternativa sin disolventes para co-extraer proteínas y aceite de la harina de cáñamo integral. En comparación con el aislado de proteína de cáñamo de referencia (R-HPI), producido a partir de harina desgrasada con hexano siguiendo la extracción alcalina convencional, el aislado de proteína de cáñamo extraído con NADES (N-HPI) tuvo un rendimiento y pureza de extracción de proteínas significativamente más altos. N-HPI mostró una carga superficial mejorada, menor hidrofobicidad y, por lo tanto, mayor solubilidad a un pH ácido en comparación con R-HPI. N-HPI tenía una mayor abundancia de edestina y niveles más bajos de proteínas similares a la vicilina, lo que contribuyó a una mejor gelificación en comparación con R-HPI. N-HPI, en comparación con R-HPI, contenía niveles más bajos de compuestos de sabor off-flavor derivados de lípidos, como aldehídos, alcoholes y cetonas. Estos hallazgos destacaron, por primera vez, el potencial de una extracción asistida por NADES de dos fases como un proceso alternativo sostenible y efectivo para producir proteína de cáñamo de alta calidad y funcional. El desarrollo de tal proceso ecológico es un impulso para ampliar las aplicaciones de la proteína de cáñamo en sistemas alimentarios.