Antecedentes: El remdesivir (RDV) es un profármaco antiviral de amplio espectro, que se metaboliza rápidamente in vivo dentro de las células al metabolito trifosfato farmacológicamente activo, GS-443902. Por otro lado, el metabolito desfosforilado GS-441524 es la forma principal detectada en plasma. El RDV actúa contra virus de ARN, y fue el primer fármaco antiviral en recibir la aprobación de la EMA y la FDA para el tratamiento de COVID-19. Sin embargo, su farmacocinética intracelular en la vida real está poco explorada, particularmente debido a desafíos técnicos. Métodos: El objetivo de este estudio fue validar un método de HPLC-MS/MS para la cuantificación directa de GS-443902 en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) con una separación cromatográfica de 15 minutos. Resultados: El método fue validado siguiendo las directrices de la EMA y la FDA en términos de sensibilidad, especificidad, precisión, exactitud, efecto matriz, recuperación, arrastre y estabilidad, y luego se aplicó a aislamientos de PBMC de una pequeña cohorte de pacientes con COVID-19 severo que recibieron RDV. Conclusiones: Este trabajo representa el primer método para la cuantificación directa de GS-443902 en PBMCs, con posible aplicación futura a estudios de farmacocinética intracelular en diferentes escenarios, como nuevos profármacos orales o estudios de interacción entre fármacos.