Un nuevo método de presentación en la superficie de levaduras para la detección a gran escala de inhibidores de la sortasa A
Autores: Wu, Lin; Li, Huijun; Tang, Tianle
Idioma: Inglés
Editor: MDPI
Año: 2017
Acceso abierto
Artículo científico
2017
Un nuevo método de presentación en la superficie de levaduras para la detección a gran escala de inhibidores de la sortasa A
Categoría
Ingeniería y Tecnología
Subcategoría
Bioingeniería
Palabras clave
Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia
Sortasa A
LPETG-EGFP
Alto rendimiento
Inhibidores
Sustratos
Licencia
CC BY-SA – Atribución – Compartir Igual
Consultas: 42
Citaciones: Sin citaciones
Los sustratos de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de la sortasa A son demasiado caros para ser utilizados en la selección aproximada de inhibidores de sortasa A de alto rendimiento. Esto dificulta la realización de estrategias terapéuticas en un uso terapéutico clínico. En su lugar, diseñamos aquí una proteína LPETG-EGFP (leucina, prolina, glutámico, treonina y glicina - fluorescencia verde mejorada) mostrada en la superficie de una levadura como sustrato al reducir adaptativamente el costo. Lo hacemos optimizando las condiciones de inducción de la expresión de sortasa A en DE3(BL21) y catalizando proteínas LPETG, que se muestran en la superficie de . Diferentes condiciones de expresión de sortasa A incluyen: temperatura de inducción (22 grados Celsius, 28 grados Celsius, 37 grados Celsius y 40 grados Celsius), tiempo de inducción (4 h, 5 h, 6 h y 7 h) y concentración de inducción de isopropil beta-tiogalactósido IPTG (0.25 mmol/L, 0.5 mmol/L, 1 mmol/L y 2 mmol/L). El cambio de fluorescencia de la proteína LPETG-EGFP en la superficie de con el tiempo fue detectado por citometría de flujo y espectrofotometría de fluorescencia, y luego se compararon las sensibilidades de los dos métodos. Utilizando cloruro de berberina como inhibidor, se investigó la actividad de sortasa A con los sustratos de la proteína LPETG-EGFP, y se comparó con Dabcyl-QALPETGEE-Edans. Se logró un alto rendimiento de sortasa A al inducir 1.0 mmol/L de IPTG a 28 grados Celsius durante 6 h. La intensidad de la fluorescencia verde de los sustratos mostrados en la superficie de la levadura aumentó con el tiempo, mientras que la estabilidad disminuyó ligeramente. Tanto la espectrofotometría de fluorescencia como la citometría de flujo eran adecuadas para la detección debido a su alta sensibilidad. Utilizamos dos sustratos diferentes de sortasa A para investigar la actividad de sortasa A, lo que resultó en el aumento de la intensidad de fluorescencia con respecto al tiempo de crecimiento incrementado. Sin embargo, el método con Dabcyl-QALPETGEE-Edans como sustrato fue más robusto. Por lo tanto, el método descrito en este documento es un método simple y económico que es muy adecuado para el análisis de alto rendimiento, pero el método convencional es mucho más sensible. Se espera que el método descrito en este documento conduzca a la selección a gran escala de inhibidores de sortasa A que puedan utilizarse para disminuir el riesgo de desarrollo de resistencia a los medicamentos.
Descripción
Los sustratos de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de la sortasa A son demasiado caros para ser utilizados en la selección aproximada de inhibidores de sortasa A de alto rendimiento. Esto dificulta la realización de estrategias terapéuticas en un uso terapéutico clínico. En su lugar, diseñamos aquí una proteína LPETG-EGFP (leucina, prolina, glutámico, treonina y glicina - fluorescencia verde mejorada) mostrada en la superficie de una levadura como sustrato al reducir adaptativamente el costo. Lo hacemos optimizando las condiciones de inducción de la expresión de sortasa A en DE3(BL21) y catalizando proteínas LPETG, que se muestran en la superficie de . Diferentes condiciones de expresión de sortasa A incluyen: temperatura de inducción (22 grados Celsius, 28 grados Celsius, 37 grados Celsius y 40 grados Celsius), tiempo de inducción (4 h, 5 h, 6 h y 7 h) y concentración de inducción de isopropil beta-tiogalactósido IPTG (0.25 mmol/L, 0.5 mmol/L, 1 mmol/L y 2 mmol/L). El cambio de fluorescencia de la proteína LPETG-EGFP en la superficie de con el tiempo fue detectado por citometría de flujo y espectrofotometría de fluorescencia, y luego se compararon las sensibilidades de los dos métodos. Utilizando cloruro de berberina como inhibidor, se investigó la actividad de sortasa A con los sustratos de la proteína LPETG-EGFP, y se comparó con Dabcyl-QALPETGEE-Edans. Se logró un alto rendimiento de sortasa A al inducir 1.0 mmol/L de IPTG a 28 grados Celsius durante 6 h. La intensidad de la fluorescencia verde de los sustratos mostrados en la superficie de la levadura aumentó con el tiempo, mientras que la estabilidad disminuyó ligeramente. Tanto la espectrofotometría de fluorescencia como la citometría de flujo eran adecuadas para la detección debido a su alta sensibilidad. Utilizamos dos sustratos diferentes de sortasa A para investigar la actividad de sortasa A, lo que resultó en el aumento de la intensidad de fluorescencia con respecto al tiempo de crecimiento incrementado. Sin embargo, el método con Dabcyl-QALPETGEE-Edans como sustrato fue más robusto. Por lo tanto, el método descrito en este documento es un método simple y económico que es muy adecuado para el análisis de alto rendimiento, pero el método convencional es mucho más sensible. Se espera que el método descrito en este documento conduzca a la selección a gran escala de inhibidores de sortasa A que puedan utilizarse para disminuir el riesgo de desarrollo de resistencia a los medicamentos.