El virus del lago de tilapia (TiLV) presenta una amenaza sustancial para la producción global de tilapia. A pesar del desarrollo de numerosas líneas celulares para el aislamiento y la propagación de TiLV, ninguna se ha derivado específicamente de tilapia híbrida roja ( spp.). En este estudio, establecimos con éxito una nueva línea celular, RHTiB, a partir del cerebro de tilapia híbrida roja. Las células RHTiB se cultivaron durante 1.5 años a través de más de 50 pasajes y demostraron un crecimiento óptimo a 25 grados C en medio Leibovitz-15 suplementado con 10% de suero bovino fetal a pH 7.4. Morfológicamente, las células RHTiB mostraron una apariencia similar a fibroblastos, y la secuenciación del gen de citocromo oxidasa I confirmó su origen de spp. Las pruebas de contaminación arrojaron resultados negativos. La tasa de recuperación de las células después de la criopreservación se observó entre el 75 y el 80% después de 30 días. El análisis cromosómico en el 25º pasaje reveló un conteo diploide de 22 pares (2n = 44). Si bien no se observaron efectos citopáticos visibles, tanto la microscopía de inmunofluorescencia como el análisis de RT-qPCR demostraron la propagación exitosa de TiLV en la línea celular RHTiB, con una concentración máxima de TiLV de 10 copias virales/400 ng de cDNA después de 9 días de incubación. El establecimiento de esta línea celular específica de la especie representa un avance valioso en las herramientas de diagnóstico y aislamiento para enfermedades virales que podrían afectar a la tilapia híbrida roja.