Las características asociadas a la dieta, como los niveles de proteína dietética, pueden modular los metabolitos primarios o secundarios del intestino, lo que lleva a efectos en el rendimiento productivo y la salud general de los animales. Mientras que los cambios en los metabolitos fecales están estrechamente asociados con el metaboloma intestinal, este estudio tuvo como objetivo observar los cambios en el perfil de metabolitos del rumen de ovejas lactantes alimentadas con diferentes niveles de proteína dietética. Para ello, dieciocho ovejas lactantes (aproximadamente 2 años de edad, con un peso corporal inicial promedio de 38.52 +/- 1.57 kg) fueron divididas en tres grupos (6 ovejas/grupo) siguiendo un diseño completamente aleatorizado, y a cada grupo se le asignó una de tres dietas de bajo contenido proteico (D_I), medio contenido proteico (D_m) y alto contenido proteico (D_h) que contenían 8.58%, 10.34% y 13.93% de contenido de proteína cruda en base seca, respectivamente. Las muestras fecales fueron sometidas a metabolómica no dirigida utilizando cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC). Los metabolomas de las ovejas alimentadas con la dieta de alto contenido proteico se distinguieron según el análisis de componentes principales de las dietas de medio y bajo contenido proteico. Las concentraciones de metabolitos fecales, así como sus patrones, cambiaron al alimentar con diferentes niveles de proteína dietética. Los metabolitos discriminantes entre grupos de ovejas lactantes alimentadas con diferentes niveles de proteína fueron identificados utilizando análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales. El enriquecimiento de rutas reveló que los niveles de proteína dietética influenciaron principalmente las rutas asociadas al metabolismo (63 y 39 en modos iónicos positivos y negativos, respectivamente), seguidas de la síntesis de proteínas (15 y 8 en modos iónicos positivos y negativos, respectivamente) y aminoácidos (14 y 7 en modos iónicos positivos y negativos, respectivamente). Los análisis multivariantes y univariantes mostraron cambios comparativos en las concentraciones fecales de metabolitos en ambos modos iónicos positivos y negativos. Se observaron cambios importantes en el metabolismo de proteínas, la biosíntesis de ácidos orgánicos y la oxidación de ácidos grasos. El análisis por pares y el PCA revelan un mayor grado de agregación dentro del grupo D-h que en todos los demás pares. En los gráficos de PCA y PLS-DA, la separación comparativa entre los grupos D_h/D_m, D_h/D_I y D_m/D_I fue superior en modos iónicos positivos y negativos, lo que indicó que las ovejas alimentadas con niveles más altos de proteína tenían alteraciones en los niveles de los metabolitos. Estos hallazgos metabólicos proporcionan información sobre los cambios potenciados de biomarcadores en el metabolismo influenciado por los niveles de proteína dietética. La identificación de objetivos puede aumentar aún más nuestro conocimiento del metaboloma intestinal de las ovejas, particularmente en lo que respecta a cómo los niveles de proteína dietética influyen en los mecanismos moleculares del metabolismo nutricional, el rendimiento de crecimiento y la síntesis de leche de las ovejas.