Este estudio tuvo como objetivo evaluar la variación en los niveles de prolina, metabolismo oxidativo y pigmentos fotosintéticos en plantas de Pitcairnia encholirioides cultivadas in vitro en diferentes condiciones y tras la aclimatación. Los análisis se realizaron tras 150 días de cultivo in vitro en medio MS suplementado con 10 µM de GA3 o 0,2 µM de ANA y sacarosa a dosis de 15 o 30 g L–1, en tubos de ensayo que permitían el intercambio de gases o en un sistema hermético, y 180 días tras la aclimatación. El mantenimiento in vitro en matraces herméticos, con GA3 y 15 g L–1 de sacarosa, tuvo efectos metabólicos adversos, lo cual se demostró por la menor acumulación de prolina y pigmentos fotosintéticos y por el aumento de la actividad de las enzimas antioxidantes. Tras la aclimatación, se desestimaron las diferencias en la prolina y los pigmentos fotosintéticos, y las actividades enzimáticas variaron de forma desigual. Los resultados sugieren que el cultivo in vitro en medios con 0,2 µM de ANA y 30 g L–1 de sacarosa, en tubos de ensayo con tapas que permiten el intercambio gaseoso, es más adecuado para la micropropagación de P. encholirioides, ya que proporciona un mantenimiento prolongado de los cultivos in vitro y plántulas de calidad superior para el desarrollo ex vitro.