El intestino delgado es importante para la digestión y absorción de nutrientes no degradables en el rumen, así como para la funcionalidad de barrera y las respuestas inmunológicas en los rumiantes. El estrés oxidativo induce un espectro de síntomas patofisiológicos y déficits nutricionales, causando diversas afecciones gastrointestinales. Estudios previos han demostrado que la nicotinamida (NAM) tiene propiedades antioxidantes, pero el mecanismo potencial no ha sido elucidado. El objetivo de este estudio fue explorar los efectos de la NAM en el daño oxidativo inducido por peróxido de hidrógeno (HO) en células epiteliales intestinales bovinas (BIECs) y su posible mecanismo. Los resultados mostraron que la NAM aumentó la viabilidad celular y la capacidad antioxidante total (T-AOC) y disminuyó la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) en BIECs desafiadas por HO. La NAM mostró una mayor expresión de catalasa, dismutasa de superóxido 2 y proteínas de uniones estrechas. La expresión de proteínas relacionadas con la autofagia aumentó en BIECs desafiadas por HO, y la NAM disminuyó significativamente la expresión de proteínas relacionadas con la autofagia. Cuando se utilizó un inhibidor específico de la autofagia, el daño oxidativo en BIECs no fue aliviado por la NAM, y la T-AOC y la liberación de LDH no se vieron afectadas. En conjunto, estos resultados indicaron que la NAM podría aliviar el daño oxidativo en BIECs al aumentar la capacidad antioxidante y la expresión de proteínas de uniones estrechas, y la autofagia desempeñó un papel crucial en el alivio.