La achicoria (L., 2n = 18), que pertenece a la familia Asteraceae, presenta un valor comestible, medicinal y forrajero significativo. Se ha realizado una investigación moderada para identificar los cromosomas de las especies de achicoria utilizando hibridación in situ por fluorescencia (FISH) y C-banding. No se han realizado comparaciones detalladas del cariotipo con la nomenclatura de cromosomas para la achicoria y especies similares. En este estudio, se predijeron y mapearon las repeticiones en tándem (TRs) a regiones cromosómicas basadas en la ensambladura del genoma L. ASM2352571 v1 publicada, y luego se compararon con el genoma de la lechuga (L.). Se desarrollaron nueve nuevas sondas oligonucleotídicas que se emplearon para la investigación cariotípica de la escarola, la lechuga y la achicoria en la metafase mitótica utilizando FISH no desnaturalizante (ND-FISH). Al combinar las sondas oligonucleotídicas conservadas para 5S rDNA y 18S rDNA con las señales únicas de ND-FISH de las nuevas sondas TR-oligonucleotídicas, podemos desarrollar un cariotipo estándar de alta resolución para los cultivares de lechuga y achicoria. La ocurrencia de variaciones en la estructura cromosómica de la población natural de achicoria y lechuga también fue revelada por ND-FISH con múltiples sondas oligonucleotídicas. La observación actual de las diferencias y divergencias del cariotipo y la investigación genómica ofrece información crucial sobre la diversidad genética de la familia Asteraceae, la dinámica cromosómica y las rutas evolutivas.