El cáncer de mama es una de las principales causas de mortalidad relacionada con el cáncer entre mujeres en todo el mundo, con millones de nuevos casos diagnosticados anualmente. Abordar la carga de la mortalidad por cáncer de mama requiere un enfoque integral que involucre la detección temprana, un diagnóstico preciso, un tratamiento efectivo y un acceso equitativo a los servicios de salud. En esta dirección, los nano-radiopharmaceuticals han mostrado potencial para mejorar el diagnóstico del cáncer de mama al combinar los beneficios de las nanopartículas y los agentes radiofármacos. Estas formulaciones a escala nanométrica pueden proporcionar capacidades de imagen mejoradas, mayor especificidad de targeting y sensibilidad aumentada para detectar lesiones de cáncer de mama. En este estudio, desarrollamos y evaluamos un nuevo radiofármaco nano-radiológico, el trastuzumab (TRZ) marcado con tecnecio-99m ([Tc]Tc)-decorado con metotrexato (MTX) y nanopartículas de albúmina sérica humana (HSA) ([Tc]-TRZ-MTX-HSA), para el diagnóstico del cáncer de mama. En este contexto, se prepararon nanopartículas de HSA y MTX-HSA. La conjugación de nanopartículas de MTX-HSA con TRZ se realizó utilizando métodos de adsorción y unión covalente. Las formulaciones preparadas fueron evaluadas por tamaño de partícula, valor de PDI, potencial zeta, análisis de microscopía electrónica de barrido, eficiencia de encapsulación, capacidad de carga y citotoxicidad en células MCF-7, 4T1 y MCF-10A. Finalmente, las nanopartículas fueron radiomarcadas con [Tc]Tc utilizando el método de radiomarcaje directo, y se realizó la captación celular con el nano-radiofármaco. Los resultados mostraron la formación de nanopartículas esféricas, con un tamaño de partícula de 224.1 +/- 2.46 nm, un valor de PDI de 0.09 +/- 0.07, y un valor de potencial de -16.4 +/- 0.53 mV. La eficiencia de encapsulación de MTX se encontró en 32.46 +/- 1.12%, y la cantidad de TRZ fue de 80.26 +/- 1.96%. El etiquetado con [Tc]Tc mostró una alta eficiencia de etiquetado (>99%). Los estudios de citotoxicidad no mostraron efecto, y los estudios de captación celular mostraron un 97.54 +/- 2.16% de captación en células MCF-7 en el minuto 120 y se encontró que tenían una captación 3 veces mayor en células cancerosas que en células sanas. En conclusión, las nanopartículas [Tc]Tc-TRZ-MTX-HSA son prometedoras para diagnosticar el cáncer de mama y evaluar la respuesta al tratamiento en pacientes con cáncer de mama.