Las nanopartículas de timoquinona (TQNPs) se utilizan ampliamente en numerosas aplicaciones farmacéuticas. En el presente estudio, probamos los efectos de la suplementación con TQNP en la calidad y cinemática del esperma, la exocitosis del acrosoma, los biomarcadores oxidativos, los cambios morfológicos y similares a la apoptosis del esperma de búfalo congelado y descongelado, así como la capacidad de fertilización. Se recolectó semen de toros búfalos, se diluyó (1:10; semen/extensor) y se dividió en cinco alícuotas que comprendían varias concentraciones de TQNP 0 (CON), 12.5 (TQNP12.5), 25 (TQNP25), 37.5 (TQNP37.5) y 50 (TQNP50) ug/mL, y luego se criopreservó y almacenó en nitrógeno líquido (-196 grados C). Los resultados revelaron que los TQNPs (25 a 50 ug/mL) proporcionaron los resultados más óptimos en términos de integridad de la membrana (0.001) y motilidad progresiva (0.01). En contraste, TQNP50 resultó en una mayor viabilidad del esperma post-descongelado (0.02) en comparación con otros grupos. La adición de TQNPs al extensor no tuvo efectos discernibles en las medidas de morfología del esperma. El movimiento cinemático del esperma mejoró significativamente en el grupo TQNP50 en comparación con el grupo de control (< 0.01). Los TQNPs redujeron efectivamente el contenido de niveles de HO y MDA y mejoraron la capacidad antioxidante total del semen extendido post-descongelado (0.01). La adición de TQNP aumentó significativamente el número de acrosomas intactos (0.0001) y disminuyó el número de acrosomas exocitados (0.0001). Se observó una reducción significativa en los cambios similares a la apoptosis en los grupos TQNP. Las tasas de no retorno de las vacas búfalas inseminadas con espermatozoides tratados con TQNP50 fueron más altas que las del grupo de control (0.05; 88% frente a 72%). Estos hallazgos sugieren que el extensor de congelación suplementado con TQNPs podría mejorar efectivamente la criotolerancia y la fertilidad del esperma de búfalo.