El ensamblaje de ribosomas es un proceso biológico complejo facilitado por más de 200 factores de acción (TAFs) que funcionan como andamios, marcadores o remodeladores de complejos para promover un ensamblaje eficiente y direccional de subunidades ribosómicas, pero que no son parte de los ribosomas funcionales. Uno de estos TAF de levadura está codificado por Mrt4, que se ensambla en complejos pre-60S en el compartimento nuclear y permanece unido a los complejos pre-60S a medida que son exportados al citoplasma. Allí, Mrt4 es desplazado de los complejos pre-60S, facilitando la posterior adición del complejo de tallo ribosómico (P0/P1/P2). Las proteínas del tallo ribosómico interactúan con GTPasas de traducción (trGTPasa) que facilitan y controlan la síntesis de proteínas en el ribosoma. El dominio de unión al rRNA de Mrt4 es estructuralmente similar a P0, con ambas proteínas uniéndose a la misma interfaz de las subunidades pre-60S de manera mutuamente exclusiva; por lo tanto, la adición del tallo ribosómico requiere el desplazamiento de Mrt4 de las subunidades pre-60S. La eliminación de Mrt4 requiere el dominio rico en cisteínas en el extremo C-terminal (CRD) de la fosfatasa de especificidad dual Yvh1. A diferencia de muchos otros TAF, las levaduras que carecen de Yvh1 son viables pero retienen Mrt4 en complejos pre-60S citoplasmáticos, lo que impide la adición del tallo ribosómico. Aunque el papel de Yvh1 en la eliminación de Mrt4 está bien establecido, cómo Yvh1 logra esto es en gran medida desconocido. Aquí, informamos sobre una pantalla genética imparcial para aislar variantes de Yvh1 que no logran desplazar a Mrt4 de los ribosomas pre-60S. Los enfoques de etiquetado de aminoácidos no canónicos bioortogonales (BONCAT) demuestran que estas variantes de pérdida de función de YVH1 también presentan defectos en la producción de proteínas nacientes. La caracterización adicional de una variante de pérdida de función, Yvh1F283L, la establece como una variante dominante negativa dependiente de la expresión capaz de interferir con la función endógena de Yvh1, y describimos cómo esta variante de Yvh1 puede ser utilizada como una nueva sonda para comprender mejor la maduración de los ribosomas y potencialmente la heterogeneidad de los ribosomas en eucariotas.