La fosforilasa de almidón (PHO) es una enzima fundamental dentro de la superfamilia GT35-fosforilasa de glucógeno (GT; glicosiltransferasas). A pesar del debate en curso sobre el papel preciso de PHO1, la evidencia apunta a su influencia sustancial en la biosíntesis de almidón, respaldada por su perfil de expresión génica y localización subcelular. Clave para la función de PHO1 es la regulación enzimática a través de la fosforilación; se han revelado una multitud de sitios de modificación en cultivos modelo. Sin embargo, las implicaciones funcionales de estos sitios aún deben ser elucidada. En este estudio, utilizamos mutagénesis dirigida por sitios en los sitios de fosforilación de PHO1, reemplazando residuos de serina con alanina, ácido glutámico y ácido aspártico, para discernir los efectos de la fosforilación. Nuestros hallazgos indican que la fosforilación no tiene impacto en la estabilidad o localización de PHO1. No obstante, nuestros ensayos enzimáticos revelaron un papel crucial para la fosforilación en el residuo S566 dentro de la región L80 de la estructura de PHO1, sugiriendo una posible modulación o mejora de la actividad de PHO1. Estos datos avanzan nuestra comprensión de la regulación de la biosíntesis de almidón y presentan objetivos potenciales para la optimización del rendimiento de los cultivos.