La piroplasmosis equina es una enfermedad transmitida por garrapatas que tiene un impacto significativo en la salud y la economía de la industria equina. Se han identificado varias especies y genotipos de piroplasma como agentes causales de esta enfermedad en caballos, y estudios recientes destacan las diferencias en el tratamiento dependiendo de la especie involucrada. Por lo tanto, conocer qué especies de piroplasma están circulando en un área específica es crucial, y se necesitan métodos de diagnóstico altamente sensibles para identificar y diferenciar el patógeno responsable de la infección. Los objetivos de nuestro estudio fueron comparar el rendimiento diagnóstico de diferentes pruebas moleculares para la detección de ADN de piroplasma y caracterizar genéticamente los piroplasmas identificados en 63 caballos en el norte de Italia desde 2016 hasta 2022. El análisis molecular reveló una tasa de positividad del 38.1% dentro de la población analizada. Notablemente, se observó una variabilidad genética sustancial entre los theileria identificados en lugar de entre los babesia. No se encontró un único método diagnóstico que pudiera detectar y diferenciar de manera confiable todas las especies de piroplasma involucradas en la piroplasmosis equina. Este estudio destaca la necesidad de investigar más a fondo la diversidad genética de estos parásitos. Ampliar nuestra comprensión de la variabilidad del piroplasma es esencial para desarrollar e implementar métodos de diagnóstico apropiados para la detección precisa de la piroplasmosis equina.