La melatonina, una hormona antioxidante secretada por la glándula pineal, ha sido reconocida como un regulador de numerosos eventos biológicos. Se han reportado previamente los efectos perjudiciales de la juglona, un extracto polifenólico de los nogales, en el desarrollo embrionario. En el presente estudio, nuestro objetivo fue mostrar el impacto de la melatonina administrada durante la maduración in vitro de ovocitos (IVM) en ovocitos tratados con juglona. Así, se recolectaron ovocitos maduros in vitro después de 24 horas de incubación con juglona en presencia o ausencia de melatonina. Se evaluaron las especies reactivas de oxígeno (ROS), el contenido de glutatión (GSH), la distribución mitocondrial y la abundancia relativa de los niveles de transcripción de ARNm en los ovocitos; además, los ovocitos fueron fertilizados in vitro para verificar los niveles de competencia de los ovocitos para generar embriones. Encontramos que la administración de melatonina durante la maduración de los ovocitos bajo estrés por juglona mejoró significativamente la tasa de segmentación, los embriones en etapa de 8-16 células y los blastocistos de día 8 en comparación con el tratamiento solo con juglona. Además, la intensidad de fluorescencia de ROS aumentó, mientras que el GSH disminuyó en los ovocitos tratados con juglona en comparación con los co-tratados con melatonina y los no tratados. Adicionalmente, se observó un aumento significativo en el patrón aberrante mitocondrial, el cual se normalizó tras la suplementación con melatonina, después de la administración de juglona. El análisis de ARNm mediante RT-qPCR reveló una regulación positiva significativa de los marcadores específicos de autofagia y estrés oxidativo en el grupo tratado con juglona en comparación con el co-tratamiento y el control. En conclusión, el estudio revela, por primera vez, un efecto protector de la melatonina contra el estrés oxidativo iniciado tras el tratamiento con juglona durante la maduración in vitro de los ovocitos.