La síntesis de proteínas con aminoácidos no canónicos (ncAAs) permite la creación de biomateriales basados en proteínas con nuevas propiedades químicas diversas que pueden resultar atractivas para la ciencia de materiales. Los métodos actuales para la producción a gran escala de proteínas que contienen ncAAs, frecuentemente llevados a cabo en , implican el uso de sintetasas de aminoacil-ARNt ortogonales (o-aaRSs) y ARNt (o-ARNt). Aunque los o-ARNt están diseñados para ser ortogonales a las aaRSs endógenas, su ortogonalidad con los componentes del metabolismo sigue siendo en gran medida inexplorada. Investigamos sistemáticamente cómo la maquinaria de modificación de ARNt afecta la eficiencia y ortogonalidad de o-ARNt utilizados para la producción de proteínas con el ncAA fosfoserina (Sep). La incorporación de Sep en una proteína fluorescente verde (GFP) en 42 cepas con deleciones de genes de modificación de ARNt únicos identificó varios genes que afectan la actividad de o-ARNt. La deleción de la desulfuras cisteína () aumentó el rendimiento de GFP que contiene Sep en más de ocho veces, mientras que la sobreexpresión de la dimetilaliltranferasa MiaA y la sintasa de pseudouridina TruB mejoraron la especificidad de la incorporación de Sep. Estos resultados resaltan la importancia de las modificaciones de ARNt para la biosíntesis de proteínas que contienen ncAAs, y proporcionan un nuevo marco para la optimización de o-ARNt.